Forschungsprojekt N-Acetyl-mannosamin-Kinase

Im Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und Pathobiochemie der Charité – Universitätsmedizin Berlin arbeitet die Arbeitsgruppe Reutter an der Charakterisierung der menschlichen N-Acetyl-mannosamin-Kinase, einem Schlüsselenzym in der Biosynthese von Sialinsäuren.

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Charakterisierung der humanen N-Acetyl-mannosamin-Kinase (MNK)

Durch ihre Schlüsselfunktion bei der Biosynthese der Sialinsäuren ist die Charakterisierung der GNE/MNK von besonderem Interesse.

Es ist uns gelungen, aktive MNK in einem prokaryontischen System zu exprimieren. Die so aufgereinigte MNK ist in Lösung ein Homodimer mit einer Masse von 70 kDa und spezifischer Aktivität für ManNAc.

In Kooperation mit der AG Saenger (FU Berlin) konnten, zusätzlich zu der bereits beschriebenen Apo-Kristallstruktur, drei neue Kristallstrukturen erzeugt werden: MNK im Komplex mit ManNAc, mit ManNAc und ADP sowie MNK im Komplex mit ManNAc-6-phosphat und ADP (Abbildung 3). Das aktive Zentrum der MNK ist in einem dichten Netzwerk von polaren und unpolaren Wechselwirkungen koordiniert. Nach der Bindung von ManNAc verändert die MNK ihre Konformation von einer offenen zu einer geschlossenen Form, wodurch die Bindung und Reaktion mit ATP ermöglicht wird.

Mit den neu gewonnen Strukturinformationen konnten MNK-Mutationen, die die autosomal rezessive neuromuskuläre Erbkrankheit Hereditary Inclusion Body Myopathy (HIBM) verursachen, neu bewertet werden. Die Aktivitäten und Substratspezifitäten der gereinigten MNK-HIBM-Mutanten korrelierten mit den Erkenntnissen aus der Kristallstruktur.

Struktur der humanen ManNAc-Kinase

Abb. 1: Struktur der humanen ManNAc-Kinase (hMNK)

Abbildung 1 (a) Die Struktur der humanen ManNAc-Kinase (hMNK) in Komplex mit ihrem natürlichen Substrat ManNAc. Der aminoterminale Anteil ist in blau dargestellt, der carboxyterminale in rot und ManNAc in grau. Die α-Helices (α) und ß-Faltblätter (ß) sind nach der Reihenfolge ihres Vorkommens in der Primärstruktur des Proteins nummeriert. Die C-terminale α-Helix 11 (α11) ragt vom carboxterminalen Anteil der hMNK bis in den aminoterminalen hinein und ist zur besseren Orientierung in grün dargestellt. Die als gestrichelte Linie dargestellte Aminosäuresequenz zwischen α6 und α7 demarkiert die flexible Region des Enzyms.

(b) Schematische Darstellung der Sekundärstrukur der hMNK. Amino- und carboxyterminaler Anteil sind entsprechend Abbildung (a) farbig getrennt voneinander dargestellt. Die Zahlen neben den einzelnen Sekundärstrukturanteilen bezeichnen die N- und C-terminalen Aminosäuren aus der Sequenz der Primärstruktur. Die Aminosäuren, die an der Bildung der Bindetasche für ManNAc beteiligt sind, sind in grünen Rechtecken hervorgehoben, diejenigen, die die Bindetasche von ADP bilden, in grauen.

(c) Darstellung des hMNK-Homodimers. Die physiologisch vorkommende, dimere Struktur der hMNK, wurde mithilfe einer kristallograpisch berechneten zweidimensionalen Achse nachmodelliert. Die Monomere A und A’ sind links als weiße Grundstruktur und rechts als blaue Grund- und Oberflächenstruktur gezeigt, die sich berührenden Anteile (1760 Ų) als rote Grund- und grüne Oberflächenstruktur.

(d) Bindetasche für Zink. Die tetrahedrale Bindungsstelle von Zn2+ (grau) besteht aus drei Cysteinresten (Schwefelatome in gelb) und einem Histidinrest (Stickstoffatom in blau). Nach der Bindung von Zink ist H569 für die genaue Orientierung bei der Koordination des O1-Atoms von ManNAc zuständig.

(e) Überlagerung der Strukturen der hMNK mit ManNAc und der apo-hMNK (apo-hMNK in grau, PDB 3EO3). Zur Vereinfachung sind die α-Helices als Zylinder dargestellt. Durch die Bindung von ManNAc bewegt sich der aminoterminale Anteil (blau) des Enzymes 12° auf den carboxyterminalen (rot).