Shedding von Membranproteinen

Ziel des Projekts ist es, Funktion und Regulation der Proteasen aufzuklären, die für die Freisetzung des humanen Serumtransferrinrezeptors 1 verantwortlich sind.

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Hintergrund

Ein Teil des membranständigen Transferrinrezeptors 1 (TfR1) gelangt in einer löslichen Form (soluble TfR1, sTfR1) ins Blut. Seine Konzentration beträgt beim gesunden Erwachsenen durchschnittlich 4,1 mg/l bis 5,8 mg/l, bei Jugendlichen und Kleinkindern 7,0 mg/l bis 7,8 mg/l. Bei verschiedenen Erkrankungen, die mit Störungen der Erythropoese oder mit Hämolyse einhergehen, kommt der sTfR in veränderter Konzentration vor und kann zur Diagnose sowie zur Therapie- und Verlaufskontrolle herangezogen werden. Verringerte sTfR-Konzentrationen treten bei hypoplastischen Erythropoesen wie aplastischen Anämien oder posttransplanten Aplasien und bei chronischem Nierenversagen auf. Erhöhte sTfR1-Konzentrationen werden bei hyperplastischen Erythropoesen beobachtet, so bei autoimmunen hämolytischen Anämien, der vererbbaren Spherozytose, β-Thalassämien, der Hämoglobin H-Krankheit und der Sichelzellenanämie. Erhöhte Konzentrationen sind ebenso nachzuweisen bei Eisenmangel, Polycythemia vera und Myelofibrose.

Obwohl der TfR1 in seiner Rolle als Endocytoserezeptor sehr gut untersucht ist und über den sTfR1 in seiner klinischen Bedeutung eine Vielzahl an Publikationen vorliegen, ist über die Entstehung des sTfR1 und seine mögliche Funktion äußerst wenig bekannt. Insbesondere ist die Protease, welche die spezifische Spaltung der Peptidbindung zwischen R100 und L101 des TfR1 katalysiert, noch nicht identifiziert. Die Spaltung erfolgt im Bereich eines molekularen Abstandhalters (stalk), der die extrazelluläre Domäne in einem Abstand von 2.9 nm von der Membran hält (Fuchs et al., 1998).

Die Bedeutung von Proteasen für wichtige biologische Funktionen an der Zelloberfläche wurde in den letzten Jahren zunehmend erkannt. Eine Vielzahl von Zelladhäsionsmolekülen, Rezeptoren und Liganden sowie Leukozyten-Antigenen wird durch Sheddingproteasen freigesetzt. Dabei sind bisher sowohl Metallo- als auch Serinproteasen beschrieben worden. Die nach der Freisetzung in der Membran verbleibenden Fragmente werden häufig weiterprozessiert und dienen als Signalmoleküle und Transkriptionsfaktoren.

Strategie und Ergebnisse

Shedding
Abbildung: Inhibition der sTfR1-Freisetzung durch spezifische Proteaseinhibitoren

Zur Aufklärung des Sheddingprozesses, bei dem das N-terminal in der Membran verbleibende Fragment des TfR1 und seine lösliche entstehen, haben wir zunächst unterschiedlichste Zellen auf ihre Sheddingaktivität hin untersucht (Kaup et al., 2002b) und festgestellt, dass auch nicht hämatopoetische Zelllinien, wie die Hepatomzelllinie HepG2, in der Lage sind, ihren TfR1 zu spalten. Die Sheddingintensität und das Molekulargewicht des freigesetzten sTfR1 variieren je nach Zelllinie, was auf eine zellspezifische Regulation und alternative Proteaseschnittstellen hindeutet (Kaup et al., 2002b). Tatsächlich konnten wir feststellen, dass die Mutation der Schnittstelle bei R100 zur erhöhten Freisetzung eines alternativen Spaltprodukts mit reduzierten Molekulargewicht führt (Dassler et al., 2003). In HL60-Zellen liegt die Hauptschnittstelle des TfR1 bei R100 (Kaup et al., 2002a) , also genau an der Stelle wie sie auch für sTfR1 im humanen Serum gefunden wurde. TfR1 von der Lymphomzelllinie U937 wird dagegen bei E110 gespalten (Kaup et al., 2002b). Das Ergebnis zeigt, dass innerhalb des TfR-stalk auch physiologisch alternative Spaltstellen existieren. Man kann daraus die Hypothese ableiten, dass diese unterschiedlichen Spaltformen des TfR1 verschiedenen Funktionen bei die Wahrung der Eisenhomöostase übernehmen.

Um die Sheddingprotease genauer zu charakterisieren, haben wie Membranständigkeit, Kinetik und pH-Abhängigkeit in einem membranbasierten Assay untersucht (Kaup et al., 2002a). Aufgrund der Ergebnisse konnten wir Aspartatproteasen ausschließen und fanden Übereinstimmungen mit einer Vielzahl an Metalloproteasen und einigen Cystein- und Serinproteasen. Inhibitorstudien zeigten, dass es sich bei der TfR1-Sheddingprotease um ein Metalloprotease handelt, die sensitiv gegenüber TAPI-2 reagiert. Sie gehört sehr wahrscheinlich zur Familie der ADAM (a disintergrin and metalloproease domain)-Proteasen wie die TNFα-Protease TACE (ADAM17) (Kaup et al., 2002a; Dassler et al., 2003).

Das detaillierte Inhibitionsprofil zeigt, dass die Spaltung an der Hauptschnittstelle und das alternative Shedding durch verschiedene Proteasen aus der gleichen Familie vermittelt wird (Dassler et al., 2003).

Aufgrund des konstitutiven Shedding ist die Spaltung des TfR1 abhängig von der Zellproliferation wie von uns mit Hilfe eines ELISAs, der zur Quantifizierung des TfR entwickelt wurde, nachgewiesen werden konnte. Dies bedeutet, dass die Sheddingrate von der Expressionsrate des TfR1 abhängt. Andererseits wird die Spaltung des TfR1 durch die Transferrinsättigung reguliert (Dassler et al., 2006). Eisenbeladenes Transferrin inhibiert direkt die Spaltung in konzentrationsabhängiger Weise, sehr wahrscheinlich durch sterische Hinderung der Proteasezugänglichkeit. Diese und obige Ergebnisse zeigen, dass Zellen ihren TfR1 autonom durch eine endogen exprimierte Protease freisetzen. Ein erhöhter intrazellulärer Eisenbedarf führt aufgrund konstitutiven Sheddings zu einem Anstieg der TfR1-Spaltung, wogegen die extrazelluläre Eisenverfügbarkeit, die durch eisenbeladenes Transferrin widergespiegelt wird, antagonistisch auf das TfR-Shedding wirkt. Dieses Resultat unterstützt die Hypothese, dass die TfR-Sheddingprodukte den Gesamteisenbedarf reflektieren und damit als Modulatoren für die Expression von Signalmolekülen des systemischen Eisenstoffwechsels wirken könnten.