Immunotoxine

Ziel des Projekts ist es, tumortherapeutische Toxinkonstrukte mit einem neuartigen molekularen Adapter zur hocheffizienten intrazellulären Wirkstoffaufnahme zu entwickeln.

Sie befinden sich hier:

Hintergrund

In der Tumortherapie stellen Tumoren, die durch lokale Behandlung nicht vollständig entfernt werden können, ein erhebliches Problem dar, da komplette, dauerhafte Remissionen durch Chemotherapie nur bei einem kleinen Teil der Tumorentitäten erreichbar sind. Nur etwa bei der Hälfte aller Tumorpatienten ist es möglich, durch Chemotherapie eine Verlängerung der Überlebenszeit zu erreichen. Daher sind immunologische Therapieansätze von größtem Interesse.

Mit der Entdeckung monoklonaler Antikörper wurde die Idee geboren, durch die Kopplung von tumorzellspezifischen Antikörpern an cytotoxische Substanzen gezielt Tumorzellwachstum zu inhibieren, während normal differenzierte Zellen unbeschadet bleiben. Statt Antikörpern werden auch Liganden für tumorzellspezifische Rezeptoren verwendet, die oft ein geringeres Molekulargewicht aufweisen und somit eine verbesserte Tumorpenetration ermöglichen. Diese chimären Toxine werden ihrer Wirkweise ebenfalls in die Gruppe der Immunotoxine eingeordnet. Bei der Entwicklung solcher effizienten Immunotoxine wurde deutlich, dass die wesentlichen Probleme in drei Ursachen begründet sind:

Die Antigenspezifität der Antikörper oder die Tumorzellspezifität des Antigens ist nicht ausreichend, so dass es auch zur Immunotoxinbindung an normal differenzierte Zellen kommt.

Die Toxine selbst binden an die Oberflächen normaler Zellen und erreichen deren Cytosol über toxineigene oder zelleigene Membrantransfermechanismen

Die Immunotoxine erreichen zwar die Zielzellen, aber es kommt zu keiner ausreichenden Aufnahme des Toxins ins Cytosol.

Darüber hinaus gibt es weitere Aspekte, die im Einzelfall dazu führen können, dass das Immunotoxin wirkungslos bleibt, z. B. intensives Shedding des Antigens und das dadurch bedingte Auftreten eines löslichen Kompetitors.

Strategie und Ergebnisse

Immuno1
Abbildung 1: Wirkung von Immunoadaptertoxinen

Zur Optimierung der Immunotoxine haben wir einen modular aufgebauten, molekularen Adapter entwickelt, der zu einer effizienten Akkumulation des Proteintoxins im Cytosol der Zielzellen führt und zudem unerwünschte Nebenwirkungen verhindert, die bislang aufgrund von hoher Stabilität herkömmlicher Linker in Immunotoxinen auftreten (Keller et al., 2001). Dieser Adapter besteht aus einem Membrantransferpeptid, das N-terminal von einer cytosolisch und C-terminal von einer endosomal spaltbaren Sequenz flankiert wird und das Toxin mit dem Liganden verbindet.

Die Abbildung 1 zeigt schematisch die Wirkungsweise des vollständigen Immunotoxins. Der tumorspezifische Ligand blockiert die Membrantransfersequenz, so dass das Konstrukt nicht unspezifisch in das Cytosol von Zellen gelangen kann (1). Nach Bindung an einen tumorspezifischen Oberflächenmarker kann das Konstrukt jedoch von Tumorzellen internalisiert werden (2). In den Endosomen wird die Bindung zwischen trojanischem Peptid und tumorspezifischem Liganden gespalten (3). Das dadurch exponierte trojanische Peptid schleust das Toxin mit hoher Effizienz in das Cytosol ein (4), wo die Bindung zum Toxin gespalten wird (5) und das Toxin die Proteinbiosynthese inaktivieren kann (6). Durch den Verlust des trojanischen Peptids kann das Toxin die Zelle nicht mehr verlassen (7) und auch nach Zellyse keine anderen normal differenzierten Zellen mehr erreichen.

Immuno2
Abbildung 2: Reaktionsschema des Adeninquantifizierungsassays (AQUA)

Eine wichtige Grundlage für die Arbeit mit Immunotoxinen besteht in dem Nachweis der Aktivität der einzelnen Bestandteile des Immunotoxins. Während die spezifische Bindung des Liganden an die Tumorzelle relativ einfach in Bindungsstudien nachgewiesen werden kann, war der Nachweis der enzymatischen Aktivität der von uns verwendeten Toxine nur auf indirektem Wege unter erheblichen Aufwand möglich. Deshalb wurde von uns ein neuartiger, nicht radioaktiver Multienzymassay entwickelt, mit dem die N-Glycosidaseaktivität, auf der die toxische Wirkung zahlreicher Proteintoxine beruht, anhand des spezifisch freigesetzten Adenins aus einem DNA-Substrat quantifiziert werden kann (Abbildung 2) (Heisler et al., 2002). Die Schlüsselreaktion ist die Umwandlung des durch das Proteintoxin Saporin aus Substrat-DNA freigesetzten Adenins zu AMP und Pyrophosphat (PPi) durch die Adeninphosphoribosyltransferase (APRT). Anschließend wird das PPi durch die Anorganische Pyrophosphatase (Anorganische PPi-ase) zu Phosphat (Pi) und das AMP durch die 5'-Nukleotidase zu Pi und Adenosin gespalten. Das photometrisch messbare Signal entsteht durch die Phosphorylyse von 2-Amino-6-Mercapto-7-Methylpurin-Ribonucleosid (MESG) zu Aminomercaptomethylpurin. Diese Reaktion wird durch die Purinnucleosidphosphorylase (PNP) katalysiert.

In unseren Immunoadaptertoxinen verwenden wir vorwiegend den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) als tumorspezifischen Liganden und die ribosomeninaktivierenden Proteintoxine Saporin und Diphtheriatoxin . Der dazwischen liegende Adapter besteht aus der endosomal spaltbaren Sequenz (zusammengesetzt aus unterschiedlichen Furinspaltstellen) und der cytosolisch spaltbaren Sequenz (zusammengesetzt aus den Erkennungssequenzen der Caspasen -1, -3, -7 und der Procaspase-3). Die beiden Spaltstellen flankieren die Membrantransfersequenz, für die wir das besonders geeignete Translokationsmotiv (TLM) verwenden (Bachran et al., 2005).

Die Funktionalität des Adapters wurde von uns zunächst in vitro nachgewiesen. Erwartungsgemäß zeigte sich für unsere Immunoadaptertoxine neben einer beeindruckenden Zielzellspezifität auch eine ausgeprägte hohe cytotoxische Aktivität (Tabelle 1).

Tabelle 1: Berechnete IC50-Werte ausgewählter Immunotoxine

Zelllinie SapAdEGF (nM) SapAd*EGF (nM) SapEGF (nM)
A431 3.2 3.2 2.9
HER14 1.1 2.1  1.5
MCF7 > 300  > 300  > 300
Immuno4
Abbildung 3: Nebenwirkung der Immunotoxine.

Der IC50-Wert ist die Konzentration an Immunotoxin, die zu einer 50%igen Inhibierung des Zellwachstums führt (gemessen im Fluoresceindiacetat-Assay). SapAdEGF und SapAd*EGF sind zwei Immunoadaptortoxine mit unterschiedlichen Adaptervarianten, bei SapEGF wurde Saporin direkt mit EGF fusioniert.

Um zu prüfen, inwieweit der Adapter in der Lage ist, die Nebenwirkungen für normal differenzierte Zellen zu reduzieren, wurde durch Zellkulturtechniken eine tumorähnliche Umgebung simuliert, bei der die Auswirkung der zielzellspezifischen Spaltung und Akkumulation des Immunoadaptertoxins auf andere Zellen untersucht wurde (Abbildung 3). Die hieraus gewonnenen Daten belegen anschaulich, dass der optimierte Adapter das Potential der Nebenwirkungen von Immunotoxinen minimiert.

Die Immunotoxine SapEGF, SapAdEGF und SapAd*EGF wurden für 6 h in Anwesenheit und Abwesenheit der Tumormodellzelllinie HER-14 vorinkubiert und anschließend ihre verbleibende Aktivität im Cytotoxizitätsassay ermittelt. Dabei zeigte sich, dass das Protein wie gewünscht inaktiviert wird. Jedoch sinkt die Aktivität auch ohne die Aufnahme in Zielzellen, was auf eine geringe Stabilität hindeutet. Durch Optimierung des Adapters konnte diese Diskrepanz beseitigt werden. In SapAd*EGF wurde bei geeigneter Plasmastabilität eine erwünschte Inaktivierung auf den Zellen festgestellt werden (Heisler et al., 2003).

Weiterführende Arbeiten zeigten, dass bei der Verwendung anderer Toxine und Liganden eine optimale Anpassung des Adapters an die jeweiligen Anforderungen erforderlich ist. Durch den auf molekularbiologischer Ebene gezielt modular gestalteten Aufbau des Adapters lassen sich jedoch seine funktionellen Bereiche problemlos austauschen, so dass sich hier die einmalige Möglichkeit bietet, Immunoadaptertoxine den notwendigen Bedingungen einer Krebstherapie in einfacher Weise anzupassen.

Die in vitro gewonnenen Erkenntnisse wurden in In vivo-Versuchen nicht nur bestätigt, vielmehr zeigte sich, dass der Effekt des Adapters im Mausmodell noch stärker zum Tragen kam. Die letale Dosis für BALB/c Mäuse war für Immunotoxin mit Adapter (SapAdEGF) gegenüber solchen ohne Adapter (SapEGF) um den Faktor 3 reduziert. Außerdem zeigte sich, dass SapEGF das durchschnittliche Tumorgewicht nur um 30 % reduzierte, während SapAdEGF eine 71 %ige Reduktion hervorrief und es dabei in 60 % der Fälle sogar zu einer kompletten Tumorsuppression kam. Nebenwirkungen wie Hyperalgesie, Alopecia und Tod, die in SapEGF-behandelten Mäusen auftraten, waren in SapAdEGF-behandelten Mäusen extrem selten. Das Wachstum von Tumoren ohne Zielrezeptor wurde durch die Immunotoxine nur äußerste geringfügig beeinflußt, wodurch deutlich wird, das das Immunotoxin spezifisch durch zielrezeptortragende Zellen aus dem Blutstrom aufgenommen und abgebaut wird (Fuchs et al., 2007).