Regulation der Eisenaufnahme

Ziel des Projekts ist es, die Struktur des Transferrinrezeptors 1 (TfR) und die Bindung seines Liganden Transferrin hinsichtlich der Regulation der zellulären Eisenaufnahme zu untersuchen.

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Hintergrund

Der Transferrinrezeptor (TfR) vermittelt über die Bindung seines Liganden Transferrin und die anschließende Internalisierung des Komplexes die Eisenaufnahme in die Zelle. Die Transportrouten des Transferrinrezeptors (TfR) während des Vorgangs von Endocytose und Recycling sind in der Literatur sehr gut beschrieben. Dagegen existieren nur unzureichende Informationen über die involvierten Regulationsmechanismen.

Es ist detailliert bekannt, dass die TfR-Expression auf RNA-Ebene durch iron-responsive elements (IRE) reguliert wird. Dagegen bestehen nur unzureichende Kenntnisse darüber, wie die Regulierung auf Proteinebene (intrazellulärer Transport, Wechselwirkung mit anderen Proteinen) erfolgt und welche Rolle dabei das Hämochromatoseprotein HFE und das Shedding des TfR spielen.

Für die Aufklärung der damit verbundenen Fragestellungen sind drei Teilaspekte von Bedeutung, in die sich das Projekt unterteilen lässt:

  • Welchen Einfluss hat der TfR auf die Ausbildung der Recyclingtubuli?
  • Welche strukturellen Merkmale des TfR können für die Regulation des TfR von Bedeutung sein?
  • Wie beeinflussen die Wechselwirkungen seiner Liganden Transferrin und HFE die Eisenaufnahme?

Strategie und Ergebnisse

REKONSTITUTION DES TRANSFERRINREZEPTORS

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Mit Hilfe von aus der Plazenta gereinigtem, humanen TfR und Sojabohnenlecithin gelang es uns, ein in vitro-Rekonstitutionssystem zu etablieren, bei dem wir den Einfluss des TfR auf die Bildung tubulärer Strukturen genau bestimmen konnten. Wir konnten zeigen, dass die Integration des TfR in Lecithinvesikel die Ausbildung langer tubulärer Strukturen bewirkt, die von der Vesikeloberfläche ausgehen. Diese Strukturen, die den tubulären Recycling-Kompartimenten lebender Zellen ähneln, könnten Selbstaggregationsereignisse widerspiegeln, die eine Rolle im Sortierungsprozess während des Recyclings von Membranproteinen aus den Endosomen zurück zur Zelloberfläche spielen. Die Abbildung zeigt ausgeprägte Tubuli nach der Rekonstitution von TfR in Sojabohnenvesikel (Fuchs et al., 1995).


STRUKTURAUFKLÄRUNG

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Die dreidimensionale Struktur des TfR ist bislang nur für die extrazelluläre Domäne (ab Aminosäure 121) aufgeklärt. Ziel des Projekts war es daher, mit Hilfe hochauflösender Elektronenmikroskopie (Negativkontrast, Cryo-EM) ein Abbild des TfR zu erzeugen, aus dem sich dreidimensionale Informationen über die Gestalt des vollständigen Rezeptors ableiten lassen. Mit Hilfe der Kryoelektronenmikroskopie konnten wir an membranrekonstituiertem Rezeptor erstmals zeigen, dass der TfR einen molekularen Abstandshalter besitzt, der den globulären Anteil der extrazellulären Domäne etwa 2,9 nm von der Plasmamembran entfernt hält. Ferner konnten wir beobachten, dass solubilisierter TfR in wässriger Lösung spezifische Aggregate (Proteopartikel) aus neun Rezeptordimeren bildet, die eine rosettenförmige Gestalt annehmen. Die Abbildungen zeigen kryoelektronenmikroskopische Aufnahmen von rekonstituiertem TfR und Proteopartikeln sowie die dazugehörigen Modelle (Fuchs et al., 1998; Orberger et al., 2001).


LIGANDENBINDUNG

Für ein besseres Verständnis der TfR-vermittelten Eisenaufnahme ist es von besonderer Bedeutung, die Bindung von Transferrin an den TfR in Abhängigkeit der Umgebungsparameter genau zu charakterisieren. Bisher wurden für den Komplex aus TfR und seinem Liganden Transferrin (Tf) in der Literatur Dissoziationskonstanten beschrieben, die bis zu einem Faktor von 240 voneinander abwichen. Die Untersuchungen zur Bindung des Transferrins an seinen Rezeptor erfolgten in vivo an Primärkulturen und Zelllinien sowie in vitro an Zellextrakten. In diesen Systemen sind größere Variationen vieler Umgebungsparameter wie des pH-Wertes, der Konzentration von Salzen und der Temperatur nicht möglich, ohne lebende Zellen in ihrem Stoffwechsel wesentlich zu beeinträchtigen. Daher kann im Einzelfall nicht exakt beurteilt werden, ob die Messergebnisse auf eine Beeinflussung der Tf-TfR-Bindung oder auf eine generelle Zellschädigung zurückzuführen sind.

Die Berechnung von Bindungskonstanten erfolgt in der Regel nach einem von Scatchard abgeleiteten Linearisierungsverfahren. Dazu erfolgt meist eine kovalente Markierung des Liganden. Dabei besteht jedoch die Gefahr, dass die Bindungseigenschaften des Liganden maßgeblich verändert werden. Dieses Problem kann zwar durch die Anwendung eines enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISA) umgangen werden, jedoch ist es bisher nicht möglich gewesen, die in einem ELISA erhaltenen relativen Absorptionswerte direkt in absolute Werte umzurechnen. Eine Analyse der Daten nach Scatchard war daher ausgeschlossen.


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Um dennoch Bindungskonstanten im ELISA bestimmen zu können, wurde von uns ein neuartiges Verfahren entwickelt, das erstmals die interne, direkte Kalibrierung eines ELISA und darüber hinaus auch die unmittelbare Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten ermöglicht (dcELISA). Die zentrale Grundlage bildet dabei der sogenannte Transferassay, bei dem der nicht gebundene Ligand nach einer definierten Inkubationszeit in eine neue Vertiefung überführt wird. Nach unendlich vielen Transfers muss die Summe aller gemessenen Absorptionen der ursprünglich eingesetzen Ligandmenge entsprechen. Durch Auftragung des Logarithmus der Absorption gegen die Transfernummer lässt sich der gesuchte Wert bereits nach wenigen Transfers extrapolieren (Fuchs et al., 1995).


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Die neue Methode des dcELISA wurde in einer umfangreichen theoretischen Analyse mit dem Scatchard-Plot und einer weiteren Methode (Liliom-Plot) verglichen. Dabei zeigte sich, dass der dcELISA (F-Plot) wesentlich robuster gegenüber experimentellen Fehlern ist als die beiden anderen Methoden.

Die Abbildung zeigt die Streuung der mit den verschiedenen Methoden bestimmten Dissoziationskonstanten in Abhängigkeit der Streuung der experimentellen Einzelwerte. Die tatsächliche Dissoziationskonstante ist in allen Fällen 1 nM. Für jede Streuintensität wurden 12 unabhängige Experimente mit jeweils 7 Einzelwerten je Messpunkt durchgeführt. Die dicken Linien zeigen die maximale, die durchschnittliche und die minimale ermittelte Dissoziationskonstante der insgesamt 84 (12 x 7) Messungen. Die anderen Linien geben bestimmte Standardabweichungen an (Fuchs et al., 2001).


Mit der Methode des dcELISA konnte wir nachweisen, dass Markierungen zum Nachweis von Proteinen im Scatchard-Blot erheblichen Einfluss auf die gemessenen kinetischen Daten aufweisen. Die Markierung von Transferrin oder auch Transferrinrezeptor mit Jod125 senken die Affinität um den Faktor 3 bis 5 von 0,22 nM auf 1,01 nM bzw. 0,66 nM. Dabei wird vor allem die Dissoziation und weniger die Assoziation beeinflusst (Fuchs et al., 2002).

Neuere Veröffentlichungen mit Hilfe der Plasmonresonanztechnologie (BIAcore) bestätigen unsere Ergebnisse.