Controlled Drug Delivery

Die mechanistischen Details, die den synergistischen Effekt zwischen Saponinen und Immunotoxinen hervorrufen, sind bisher völlig unverstanden und sollen im Rahmen dieses Projektes charakterisiert werden. Die gewonnen Erkenntnisse werden dazu beitragen, die grundsätzlichen Prinzipien einer hocheffizienten Kombinationstherapien zu verstehen.

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Saponine

Abbildung: Struktur von Gypsoid A, der Hauptanteil im Saponinum album.

Saponine stellen eine sehr heterogene Gruppe von pflanzliche Glykosiden dar, die aus einem steroiden oder triterpenoiden Aglykon bestehen, an das ein oder mehrere Zuckerkette geknüpft sind. Die große Bandbreite an Saponinen beruht auf der Variabilität der Aglykonstruktur, der Zuckerseitenketten und ihrer Zusammensetzung. Obwohl Saponine in vielen Bereichen vor allem aber in der Medizin Einsatz finden, ist ihre ursprüngliche Funktion in der Pflanze immer noch ungeklärt. 

Kürzlich wurde ein natürlich vorkommender synergistischer Mechanismus zwischen Saponinen und Pflanzengiften beschrieben. Bisher wurde angenommen, dass die Toxizität von Agrostemma githago L. Samen auf dem in ihnen enthaltenen Saponinanteil beruht. Jedoch zeigte sich, dass es sich hier vielmehr um eine kombinierte Wirkung von Saponin und Agrostin, einem ribosomeninaktiverenden Protein (RIP) der Typs I handelt. Der kombinierte Einsatz von Saponinen mit anderen Antitumormedikamenten eröffnet somit eine interessante Entwicklung in der Krebstherapie.

Strategie und Ergebnisse

Unsere Untersuchungen fokussieren sich auf die Frage, ob Saponin die spezifische Aufnahme von Immunotoxinen mit zielgerichtetem Liganden vermittelt. Dazu haben wir systematisch die kombinierte Wirkung von Saponin und dem EGF-Ligand tragenden Immunoadaptertoxin SapAd*EGF untersucht (Heisler et al., 2005).

Zellkulturexperimente zeigen, dass die Sensitivität gegenüber SapAd*EGF um das 3600fache erhöht wird, wenn HER-14-Zellen (mit humanem EGF-Rezeptor transfizierte NIH3T3-Zellen) zuvor 5 min mit 1,5 µg/ml Saponin behandelt werden. Der IC50-Wert wird dadurch erheblich von 2,4 nM auf 0,67 nM reduziert. Für die humane Brustadenokarzinomzelllinie MCF-7 steigt die Zytotoxizität sogar um das 385000fache.

Tabelle: Erhöhung der spezifischen Toxizität (IC50-Werte in nM) durch Saponin.

Zelllinie
mit Saponin
SapAd*EGF
1.5 µg/ml Saponin

Verstärkungsfaktor
HER14 2.4  0.00067 3560
MCF-7  1040  0.0027 385000
NIH-3T3  135  0.13 1050

Bei unseren Untersuchungen sind besonders folgende Teilaspekte hervorzuheben:

  • Bei optimalen Konzentrationen an Saponin und Immunoadaptertoxin ist die separate Gabe der einzelnen Komponenten vollkommen untoxisch, was die synergistische Wirkung beweist
  • Das Wachstum von untransfizierte NIH3T3-Zellen wird durch die Kombination von Saponin und Immunoadaptertoxin bei optimalen Konzentrationen nicht beeinflusst. Der Prozess ist demnach tatsächlich vom Zielrezeptor abhängig.
  • Das ligandfreie Toxin hat keine Wirkung auf HER-14-Zellen. Somit ist die Rezeptorligandwechselwirkung Voraussetzung für Zytotoxizität.
  • Die Aktivität des Saponins wird durch seine strukturellen Komponenten (die Anzahl der Zuckereinheiten, deren Komposition und die funktionellen Gruppen des Aglykons) beeinflusst.
    (Bachran et al., 2006; Heisler et al., 2005)

Dadurch, dass die Dosis an Immunotoxin in Kombination mit Saponin so stark reduziert werden kann, werden nicht nur seine Nebenwirkungen erheblich reduziert, sondern auch die Produktionskosten für das rekombinante Protein, wodurch ein ökonomische Einsatz und eine breite Anwendbarkeit möglich werden kann. Für die hier beschriebene Methode zur Kombinationstherapie wurde ein Patent beim europäischen Patentamt unter der Nummer 04016497.2 eingereicht.

Gegenstand unserer aktuellen Forschung ist nun die Übertragung der Zellkulturexperimente in das Mausmodell und die Aufklärung des dahinter stehenden molekularen Mechanismus.

CESTRA

Eine gerichtete Gentherapie erfordert eine zell- und / oder gewebespezifische Überexpression oder auch eine Expressionsinhibition von therapeutischen Genen. Mit der Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) und ihrer Anwendung zur Herabregulation von Zielgenen mittels siRNA stieg auch das Interesse, diese Methode in der Gentherapie einzusetzen. Das Hauptproblem bei der Verwendung von siRNA in vivo besteht in ihrem gerichteten Transport durch die Zellmembran in das Cytosol hinein.

Strategie und Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des zellspezifischen Transfektionsreagenz
Abbildung 1: Schematische Darstellung des zellspezifischen Transfektionsreagenz

Der Transport in die Zelle wird durch eine spezifischen Mechanismus erreicht. Der therapeutische Bestandteil (DNA oder siRNA) wird über eine Nukleinsäurebindungsdomäne an einen zielzellspezifischen Liganden gekoppelt, der mit der Bindungsdomäne über einen multifunktionellen molekularen Adapter verbunden ist, der in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde. Der Adapter gewährleistet den gerichteten Transport durch die Membran in die Zelle hinein (siehe Immunotoxinprojekt).

cestra2
Abbildung 2: GFP-Transfektion von EGF-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen mit CESTRA. HEK-293-EGFR-Zellen wurden mit einem Komplex aus 10 µg DNA-b8-EGF und 1.5 µg pEGFP-N3 transfiziert und nach 48 h mikroskopiert. Links: Phasenkontrastaufnahme; rechts: Fluoreszenzaufnahme von GFP-exprimierenden Zellen.

Für das Proof of Principle wurde Grünfluoreszierendes Protein (GFP)-exprimierender Vektor mit Hilfe von EGF als zielgerichteter Ligand in EGF-Rezeptor exprimierende Zellen geschleust (Abbildung 2). NIH3T3-Zellen, die keinen detektierbaren EGF-Rezeptor exprimieren, können dagegen nicht transfiziert werden. Die Expression von EGF-Rezeptor ist somit eine Voraussetzung für die Transfektion, was zeigt, dass das Transfektionssystem eine hohe Zielzellspezifität aufweist.

Aufgrund unserer Ergebnisse im Saponin-Projekt haben wir untersucht, ob die Transfektionseffizienz durch Zugabe dieser Tripernoide gesteigert werden kann. Tatsächlich zeigen unsere Ergebnisse, dass Saponin die Transfektionsrate um den Faktor 6 erhöht. Die höhste Transfektionseffizienz (36 %) wurde in EGF-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen beobachtet. Im Folgenden soll nun das System für siRNA und siRNA-Vektoren überprüft werden, die eine Herabregulation der GFP-Expression hervorrufen. Außerdem wird das Transfektionssystem für ansonsten schwierig zu transfizierenden Zellen wie Monocyten und Makrophagen getestet werden.