CESTRA

Im Mittelpunkt des Projektes der AG Fuchs steht die Entwicklung eines zellspezifischen Transfektionssystems, welches einen effizienten Transport von exogenen Genen und siRNA in die Zellen vermittelt (CEll-Specific TRansfection Assay).

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Hintergrund

Eine gerichtete Gentherapie erfordert eine zell- und / oder gewebespezifische Überexpression oder auch eine Expressionsinhibition von therapeutischen Genen. Mit der Entdeckung der RNA-Interferenz (RNAi) und ihrer Anwendung zur Herabregulation von Zielgenen mittels siRNA stieg auch das Interesse, diese Methode in der Gentherapie einzusetzen. Das Hauptproblem bei der Verwendung von siRNA in vivo besteht in ihrem gerichteten Transport durch die Zellmembran in das Cytosol hinein.

Strategie und Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des zellspezifischen Transfektionsreagenz
Abbildung 1: Schematische Darstellung des zellspezifischen Transfektionsreagenz

Der Transport in die Zelle wird durch eine spezifischen Mechanismus erreicht. Der therapeutische Bestandteil (DNA oder siRNA) wird über eine Nukleinsäurebindungsdomäne an einen zielzellspezifischen Liganden gekoppelt, der mit der Bindungsdomäne über einen multifunktionellen molekularen Adapter verbunden ist, der in unserer Arbeitsgruppe entwickelt wurde. Der Adapter gewährleistet den gerichteten Transport durch die Membran in die Zelle hinein (siehe Immunotoxinprojekt).

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Abbildung 2: GFP-Transfektion von EGF-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen mit CESTRA. HEK-293-EGFR-Zellen wurden mit einem Komplex aus 10 µg DNA-b8-EGF und 1.5 µg pEGFP-N3 transfiziert und nach 48 h mikroskopiert. Links: Phasenkontrastaufnahme; rechts: Fluoreszenzaufnahme von GFP-exprimierenden Zellen.

Für das Proof of Principle wurde Grünfluoreszierendes Protein (GFP)-exprimierender Vektor mit Hilfe von EGF als zielgerichteter Ligand in EGF-Rezeptor exprimierende Zellen geschleust (Abbildung 2). NIH3T3-Zellen, die keinen detektierbaren EGF-Rezeptor exprimieren, können dagegen nicht transfiziert werden. Die Expression von EGF-Rezeptor ist somit eine Voraussetzung für die Transfektion, was zeigt, dass das Transfektionssystem eine hohe Zielzellspezifität aufweist.

Aufgrund unserer Ergebnisse im Saponin-Projekt haben wir untersucht, ob die Transfektionseffizienz durch Zugabe dieser Tripernoide gesteigert werden kann. Tatsächlich zeigen unsere Ergebnisse, dass Saponin die Transfektionsrate um den Faktor 6 erhöht. Die höhste Transfektionseffizienz (36 %) wurde in EGF-Rezeptor exprimierenden HEK-293-Zellen beobachtet. Im Folgenden soll nun das System für siRNA und siRNA-Vektoren überprüft werden, die eine Herabregulation der GFP-Expression hervorrufen. Außerdem wird das Transfektionssystem für ansonsten schwierig zu transfizierenden Zellen wie Monocyten und Makrophagen getestet werden.